การศึกษาการเตรียมและการทดสอบความบริสุทธิ์ทางเคมีรังสี  
ของเทคนีเซียม-99m  ที่ติดสลากกับสารกลุ่มฟลาโวนอยด์ (Catechin,WP0280,Kaempferol)

ชื่อผู้เขียน                              นางสาวญาณัจฉรา  วุฒิ
ชื่อปริญญา                            วิทยาศาสตรบัณฑิต (รังสีเทคนิค)

อาจารย์ที่ปรึกษา                   อาจารย์ ดร.วินิจ  ช้อยประเสริฐ

บทคัดย่อ

          อนุมูลอิสระ (free radical) และสภาวะความเครียดออกซิเดชัน (oxidative stress) เป็นสาเหตุหลักของโรคเรื้อรังหลายชนิด เช่นโรคมะเร็งและโรคหัวใจ ส่วน Flavonoids(Catechin,WP0280,Kaempferol)  เป็นสารพี่พบในธรรมชาติ มีศักยภาพในการต่อต้านสารอนุมูลอิสระ การเตรียมและการประเมินผลการติดสลากของเทคนีเชียม-99m กับ Flavonoids(Catechin,WP0280,Kaempferol) ซึ่งเป็นสารที่มีความสามารถในการเป็น radiotracer ไปจับกับสารอนุมูลอิสระ โดย 99mTc- Fla complex ถูกเตรียมขึ้นจาก Flavonoids (Catechin,WP0280,Kaempferol) กับ SnCl2 และ Na99mTcO4 บ่มในสารละลายบัฟเฟอร์ เป็นเวลา 30 นาที ประสิทธิภาพในการจับกันของคอมเพล็กซ์สามารถประเมินได้จากการหาค่าเปอร์เซ็นต์ Free 99mTcO-4    และความเสถียรของคอมเพล็กซ์สามารถหาได้จาก ความบริสุทธิ์ทางเคมีรังสี radiochemical purity จากวิธีทางโครโมโทกราฟฟี่ thin layer chromatography (TLC) โดยใช้ normal saline solution เป็น mobile phase ที่เวลาต่างๆกัน

บทนำ

          สารในกลุ่ม flavonoids เป็นสารธรรมชาติที่พบได้ทั่วไปในพืช สารเหล่านี้มีคุณสมบัติทางเภสัชวิทยา คือมีฤทธิ์ในการต่อต้านอนุมูลอิสระ ต้านมะเร็ง และต้านการ อักเสบในตรงกันข้ามสารอนุมูลอิสระที่เกิดขึ้นในร่างกายก็ส่งผลให้เกิดภาวะความเครียดออกซิเดชัน (oxidative stress)และโรคเรื้อรัง เช่นโรคมะเร็ง โรคหัวใจและหลอดเลือด เนื่องจากสาเหตุที่กล่าวมานี้ผู้วิจัยจึงต้องการศึกษาการจับกันของเทคนีเซียมฟลาวานอยด์คอมเพล็กซ์ หาเปอร์เซ็นต์การจับของคอมเพล็กซ์ต่อ Free 99m TcO-4  ด้วยวิธีโครมาโทกราฟฟี่และหาความเสถียรในการจับกันของคอมเพล็กซ์ที่เวลา 1, 2, 3, 4 ,8 , 12 และ 24 ชั่วโมงตามลำดับ เป้าหมายของการศึกษานี้ก็เพื่อเตรียมและประเมินผลการจับของเทคนีเซียมกับสารกลุ่มฟลาวานอยด์ซึ่งสารดังกล่าวนี้เป็นสารที่มีศักยภาพในการไปจับกับอนุมูลอิสระในร่างกายและเป็นตัวบ่งชี้สภาวะความเครียดออกซิเดชัน (oxidative stress)ได้ ทางผู้วิจัยมีความคาดหวังว่างานวิจัยชิ้นนี้จะได้รับการศึกษาต่อยอดเป็นการศึกษาวิจัยแบบ In vivo และนำไปใช้ในทางคลินิกต่อไป

♔ ♕ ♖ ♗ ♘ ♙ ♚ ♛ ♜ ♝ ♞ ♟♔ ♕ ♖ ♗ ♘ ♙ ♚ ♛ ♜ ♝ ♞ ♟♔ ♕ ♖

Catechin

แคทีชิน (catechin) เป็นสารในกลุ่มสารประกอบฟีนอล (phenolic compounds) ประเภทพอลิฟีนอล (polyphenol) ในกลุ่มฟลาโวนอยด์ (flavonoids) ที่พบมากในใบชา (tea) เป็นสารโภชนะเภสัช (nutraceutical) ที่มีศักยภาพในด้านประโยชน์กับสุขภาพ มีฤทธิ์เป็นสารต้านออกซิเดชัน (antioxidant) ที่จับกับอนุมูลอิสระ และเป็น chelating agent ที่รวมตัวกับไอออนของโลหะหนักได้

http://www.foodnetworksolution.com/wiki/word/3146/catechin

Kaempferol

Kaempferolบริสุทธิ์เป็นผงสีเหลือง เป็นหนึ่งใน flavonoids สำคัญที่สุดและแพร่หลายมากที่สุด

Keampferolเป็นสารต้านอนุมูลอิสระที่แข็งแกร่งและยังช่วยป้องกันความเสียหายที่เกิดเป็นเซลล์ไขมันและดีเอ็นเอ

http://jiaogulan4u.blogspot.com/2011/04/kaempferol.html

WP0208

♔ ♕ ♖ ♗ ♘ ♙ ♚ ♛ ♜ ♝ ♞ ♟♔ ♕ ♖ ♗ ♘ ♙ ♚ ♛ ♜ ♝ ♞ ♟♔ ♕ ♖

วัตถุประสงค์

-                   เพื่อศึกษาการเตรียมสารเภสัชรังสี เทคนิเชียม99เอ็มที่ติดกับสารกลุ่มฟลาเวอนอยด์(Catechin,WP0280,Kaempferol)

-                   เพื่อทดสอบความบริสุทธิ์ของสารเภสัชรังสีเทคนิเชียมที่ติดกับสารฟลาเวอนอยด์ด้วยวิธี Paper Chromatography

-                   เพื่อทดสอบความเสถียรของสารเภสัชรังสีที่เตรียม

♔ ♕ ♖ ♗ ♘ ♙ ♚ ♛ ♜ ♝ ♞ ♟♔ ♕ ♖ ♗ ♘ ♙ ♚ ♛ ♜ ♝ ♞ ♟♔ ♕ ♖

อุปกรณ์การทดลอง

1.            Catechin

2.            WP 0280

3.            Kaempferol

4.            Na^99mTcO₄^-

5.            SnCl₂

6.            Phosphate buffer solution (PBS)

7.            Thin layer chromatography (whatman)

8.            0.9%NaCl saline solution

9.            DMSO

10.          Test tube

11.          Forceps

12.          Dose calibrator

13.         Single probe

14.         Survey meter

♔ ♕ ♖ ♗ ♘ ♙ ♚ ♛ ♜ ♝ ♞ ♟♔ ♕ ♖ ♗ ♘ ♙ ♚ ♛ ♜ ♝ ♞ ♟♔ ♕ ♖

การเตรียม ^99mTc-Flavonoids (Catechin,WP0280,Kaempferol) complex

1.            เตรียมสารละลาย Flavonoids (Catechin,WP0280,Kaempferol) ปริมาณ 500 µL โดยใช้ DMSO เป็นตัวทำละลาย (ความเข้มข้น 1 mg / ml)  

2.            เตรียมสารละลาย SnCl2 + 0.9%NaCl saline solution

3.            ผสมสารละลาย Flavonoids (Catechin,WP0280,Kaempferol) 500 µL (1 mg / ml) กับ SnCl₂  + 0.9%NaCl saline solution 30 µL และสารละลายฟอสเฟตบัฟเฟอร์ 200 µL โดยผสมในขวดแก้วขนาด 5 มิลลิลิตร

4.            เติม Na ^99mTcO₄^-ปริมาณ 150  µL (~3.79 *108Bq) ในสารละลายดังกล่าว

5.            ผสมให้เข้ากันและเก็บไว้ที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 30 นาที

6.            ตรวจสอบ99mTc- Flavonoids(Catechin,WP0280,Kaempferol) complex โดยใช้ thin layer chromatography(TLC)

7.            ใช้กระดาษกรอง whatmanเป็น Stationary phase และใช้สารละลาย 0.9%NaCl saline ใช้เป็น mobile phase

8.            ^99mTc- Flavonoids(Catechin,WP0280,Kaempferol) complex จะไม่เคลื่อนที่และยังอยู่ที่จุด origin แต่ 99mTcO4- จะเคลื่อนที่ไปอยู่ด้านบนของแถบ

9.            Flavonoids(Catechin,WP0280,Kaempferol) ที่อยู่ในรูปอิสระจะเคลื่อนที่ไปอยู่ด้านบนของแถบกับสารละลายที่มีขั้ว (ในที่นี้ใช้ 0.9%NaCl saline solution)

10.          แต่ metal-complexes ของ Flavonoids(Catechin,WP0280,Kaempferol) ยังคงอยู่ที่จุด origin และไม่เคลื่อนที่

11.          สีเหลือง-เขียวของ Flavonoids(Catechin,WP0280,Kaempferol) สังเกตเห็นได้ง่ายที่จุด origin ซึ่งแสดงให้เห็นคอมเพล็กซ์ระหว่าง Flavonoids(Catechin,WP0280,Kaempferol) กับเทคนีเชียม

13.          ตัดแถบ Thin layer chromatography (whatman) แบ่งเป็นสองส่วนความยาวเท่าๆกัน แล้วนำไปวัดกัมมันตภาพรังสีด้วยเครื่อง  Dose calibrator

14.          นำค่าที่ได้ไปหาค่าเปอร์เซ็นต์ Free ^99mTcO^-₄  แล้วบันทึกผล

15.          ทำการทดลองซ้ำจำนวนสามครั้งเพื่อหาความแปรปรวน

16.          นำ Catechin, WP0280, Kaempferol, Tc99m, 99mTc-Catechin, 99mTc-WP, 99mTc- Kaempferolนำมาวัดค่าดูดกลืนแสงจากเครื่อง spectrophotometer

17.          บันทึกกราฟที่ได้ แล้วนำมาเปรียบเทียบค่าการดูดกลืนแสงของสารกลุ่ม ฟลาเวอนอยด์และcomplex

♔ ♕ ♖ ♗ ♘ ♙ ♚ ♛ ♜ ♝ ♞ ♟♔ ♕ ♖ ♗ ♘ ♙ ♚ ♛ ♜ ♝ ♞ ♟♔ ♕ ♖

ความเสถียรของ^99mTc- Flavonoids (Catechin,WP0280,Kaempferol) complex 

ใน phosphate buffer saline(PBS)

          ความเสถียรของ ^99mTc-Fla complex ถูกกำหนดโดยระยะเวลาที่ใช้ในการบ่มสารละลายใน phosphate buffer saline  ในเวลาที่แตกต่างกัน คือ 1, 2, 4, 8, 12และ 24 ชั่วโมง โดยเติมสารละลาย ^99mTc-Fla complex ปริมาณ 100 µL  ใน phosphate buffer saline(PBS) 1 มิลลิลิตร แล้วนำส่วนผสมที่ได้นี้ปริมาณ 10 µL ไปหยดใส่แถบ TLC แล้วหาค่าเปอร์เซ็นต์เยลด์ของ ^99mTc-Fla complex กับ Free ^99mTcO^-₄ 

♔ ♕ ♖ ♗ ♘ ♙ ♚ ♛ ♜ ♝ ♞ ♟♔ ♕ ♖ ♗ ♘ ♙ ♚ ♛ ♜ ♝ ♞ ♟♔ ♕ ♖

ผลการทดลอง

♔ ♕ ♖ ♗ ♘ ♙ ♚ ♛ ♜ ♝ ♞ ♟♔ ♕ ♖ ♗ ♘ ♙ ♚ ♛ ♜ ♝ ♞ ♟♔ ♕ ♖

สรุปผลการทดลอง

       Paper Chromatography แสดงให้เห็นว่าสารเภสัชรังสีที่เตรียมขึ้นทั้ง3ชนิด มี% labeling น้อยกว่า 90% และมีช่วงความคลาดเลื่อนของข้อมูลค่อนข้างสูงจากวิธีวัดการดูดกลืนแสงไม่สามารถยืนยันได้ว่า 99mTc-Catechin99mTc-Kaempferolและ 99mTc-WP เกิด complex สารเภสัชรังสีมีความเสถียรลดลงเมื่อเวลาผ่านไปมากขึ้น

♔ ♕ ♖ ♗ ♘ ♙ ♚ ♛ ♜ ♝ ♞ ♟♔ ♕ ♖ ♗ ♘ ♙ ♚ ♛ ♜ ♝ ♞ ♟♔ ♕ ♖

อภิปรายผลการทดลอง

      ผลจากการทำ Paper Chromatography แสดงให้เห็นว่าสารเภสัชรังสีที่เตรียมขึ้นทั้ง3ชนิด มี% labeling น้อยกว่า 90% และมีช่วงความคลาดเลื่อนของข้อมูลค่อนข้างสูง และเมื่อนำ complex ทั้ง3มาวัดค่าการดูดกลืนแสงด้วยเครื่อง spectrophotometer พบว่า

                99mTc-Catechinมีการดูดกลืนแสงที่ความยาวคลื่นเดียวกับ Catechin

                99mTc-Kaempferolมีการดูดกลืนแสงที่ความยาวคลื่นเดียวกับ Kaempferol

                99mTc-WP มีการดูดกลืนแสงที่ความยาวคลื่นเดียวกับ WP

ภาพรวมของกราฟจะเห็นว่ามีการลดลงของ % labeling เมื่อเวลามากขึ้น

♔ ♕ ♖ ♗ ♘ ♙ ♚ ♛ ♜ ♝ ♞ ♟♔ ♕ ♖ ♗ ♘ ♙ ♚ ♛ ♜ ♝ ♞ ♟♔ ♕ ♖

ภาคผนวก